多玛克科技（北京）有限公司-产品中心

多玛克科技（北京）有限公司本着“探索生命色彩构建多维视野” 的公司愿景，以“立足科研服务诊疗” 为使命，以高端染色及分析为核心技术，面向科研及医疗诊断用户提供优质、精准的多重免疫荧光染色及原位表型分析服务。多玛克专注于病理样品处理及多重免疫荧光领域的实验服务，引进科研级自动化病理处理及分析设备，制定严格的实验室SOP标准，可以减少人为操作带来的误差，更好的保证实验操作的一致性，提高实验结果的准确性和重复性，全力保证染色的质量，为每一例样本保驾护航。同时采用国际先进的分析技术，将大数据立体化呈现给广大科研、医疗工作者，使实验数据最大限度得到充分的利用，协助您探索生命的奥秘。

多玛克简介

什么是TSA？

TSA是酪胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification）之简称。利用基于IHC免疫组化的“<一抗-二抗-HRP＞底物”原理及步骤，TSA荧光化合物在HRP催化下与靶点附近的酪氨酸残基结合，生成稳定荧光化合物。与普通免疫荧光相比，TSA技术：

● 可将信号放大10-1000倍。

● 荧光化合物具有理想的光、热、pH稳定性。

● 多色荧光标记不受一抗种属限制。

TSA多色荧光标记为什么要去除抗体？

同种属一抗在同一样本中的多色荧光标记一直是难题。 TSA技术利用荧光化合物的热稳定性，采用微波煮沸的方式将附着在样本上的<一抗-二抗-HRP>复合物变性和解离，而荧光化合物则始终结合在样本原位。

在下一轮TSA荧光标记过程中，新的<一抗-二抗-HRP＞复合物将新的荧光化合物结合样本原位。

通过N轮重复的“标记→抗体解离”步骤则能标记N种荧光。这是TSA多色荧光标记不受一抗种属限制的原理和精髓。

● 一抗选择：选择好用的一抗及其组合，TSA多色荧光标记成功了一半！

选择用于临床病理诊断的抗体。

选择文献报道的抗体。

尽量选择单抗，谨慎选择多抗。

小鼠标本不要选择小鼠来源的一抗（细胞染色除外）。

石蜡样本推荐Abcam标注IHC-P的抗体，尤以KO-VALIDATED （敲除验证）为佳。

● 二抗选择：好的二抗也很重要！

使用经过预吸附（也称交叉吸附）的二抗，以降低潜在物种交叉反应导致的非特异性背景，这对免疫细胞丰富的样本尤其重要。

尽量选择HRP直接标记的二抗：节省实验流程，提高特异性。

选择HRP多聚体二抗，可显著提高信噪比。

● 利用阳性样本进行抗体特异性验证：具有专业知识背景很重要！

查阅发表文献，获知抗原表达及抗体特异性的关键信息。

建议从DAB显色的IHC开始。

根据信号的组织定位、细胞定位、胞膜/胞核/胞浆/细胞器定位，综合验证抗体特异性。记录获得最佳信号的一抗浓度、孵育时间和温度，二抗孵育时间，显色时间等关键信息。

抗体的选择

TSA与IHC、IF的区别

● TSA vs. IHC：注意样本自发荧光

都依靠HRP的催化作用：IHC形成DAB沉淀，TSA形成活性荧光化合物。

TSA信号放大作用显著强于DAB。请适量降低根据IHC 确定的一抗浓度。

TSA荧光多标需考虑样本自发荧光的影响，如角蛋白丰富的样本、脂褐质丰富的脑组织和淋巴瘤样本、骨组织及骨髓样本、过固定样本等。请在开始标记前确定样本是否有自发荧光。可利用TissueGnostics的光谱拆分功能对背景荧光进行扣除，或在标记时避免使用和自发荧光同一通道的TSA染料。

● TSA vs. IF:防止信号放大过度

TSA信号放大过度现象在以IF为经验的用户中比较突出，特别是细胞TSA荧光标记。

TSA和IF虽然都属于荧光信号放大，但原理不尽相同。 IF流程无需去除内源性过氧化物酶；TSA标记请务必去除组织或细胞中的内源性过氧化物酶，特别是肝脏、肾脏、骨、免疫器官来源的组织和细胞，否则会造成较强的背景染色。

IF:信号等比放大；TSA:信号非线性放大

IF:1-2个二抗可结合1 个一抗，1 个二抗可标记1-3个荧光分子＞信号最多放大2X3=6倍。放大效应不会随着时间延长。

TSA:HRP酶促反应在线性期内(0~T2)可持续活化10-1000个荧光分子，反应最终饱和，进入平台期(T2- T3)。平台期之后，不同位点之间信号的差异会被逐渐拉平。

以CEP164的表达为例:CEP164在细胞中心体中高表达，在睫状囊泡中低表达，但在TSA标记过程中，过长反应时间(15min)缩小了这种差异，让睫状囊泡中的信号看起来和中心体一样强。

由此可见,TSA对于低丰度靶点的检出具有巨大优势，但也要考虑信号放大过度造成的影响：对于中高丰度靶点，请从原一抗浓度1 /10-1 /5开始测试使用TSA。细胞实验请将TSA从1:200~500稀释开始测试。

设置反应时间梯度，记录最佳反应时间。如需考虑表达差异，应在T2之前中止反应。

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TSA荧光化合物在HRP催化下发生活化，与靶点附近的酪氨酸残基结合生成稳定的荧光化合物。在多色标记过程中，当两个靶点抗原距离接近时，上一轮反应将抗原附近的酪氨酸耗竭，导致下一轮荧光结合不上的问题，称为占位效应。

● TSA荧光化合物的作用半径为5~10nm,半径外的占位效应不会发生。

● 组织中的酪氨酸位点较为丰富，占位效应并不经常发生。

● 占位效应通常发生在距离接近且表达差异较大的靶点之间，例如PD1和CD3,如果先做CD3并且信号放大过度，确实会导致PD1 染色弱甚至染不上的问题；某些表达广泛且丰度高的靶点，例如外源性表达的GFP分子，在信号放大过度时也可能会耗竭整个细胞的酪氨酸位点。

解决办法：“先低后高”、“先少后多”和适度原则：先染丰度低、表达范围少的靶点，后染丰度高、表达范围广的靶点。

TSA的占位效应

染色先后顺序的确立

在TSA多色荧光标记中，每种荧光都与样本牢牢结合，一旦某个靶点标记失败则无法回头，导致前功尽弃。科学设置染色先后顺序，有助于顺利获得理想结果。

● 抗体必须逐个验证

在熟悉每个靶点及对应抗体的情况之前，不要贸然做多色标记。

● 靶点先后顺序的选择

不能长时间修复的抗原，安排到第一轮；需长时间修复的则安排到最后一轮。

遵循上述“先低后高”、“先少后多”原则。如果存在难以去除的抗体，请安排到最后一轮。

● 荧光先后顺序的选择

对于工业用户或者染色工作量大的用户，工作流程可能不包括镜下观察每轮染色效果，因此通常不考虑荧光先后顺序（俗称“盲染”）。请遵循平衡原则。

对于科研用户，边染边观察是值得鼓励的流程。通道之间无先后顺序考量，但在同一通道内，建议先染低丰度靶点荧光，后染高丰度靶点;尽量先染短波长荧光，后染长波长荧光。

产品目录

多重荧光染色试剂盒套装

单色荧光染料

其他辅助试剂

仅供科研，不用于临床诊断

更多规格、染色组合，请咨询业务人员。

应用案例

人肺癌组织5色

人结肠癌组织6色

小鼠脑组织6色

人肺腺癌组织7色

人阑尾组织7色

人结肠癌组织10色

相关文献

01、Identification of cervical cancer stem cells using single-cell transcriptomes of normal cervix, cervical premalignant lesions, and cervical cancer eBioMedicine 2023

02、A type I interferon footprint in pre-operative biopsies is an independent biomarker that in combination with CD8+ T cell quantification can improve the prediction of response to neoadjuvant treatment of rectal adenocarcinoma OncoImmunology 2023

03、A Deep-Learning-Computed Cancer Score for the Identification of Human Hepatocellular Carcinoma Area Based on a Six-Colour Multiplex Immunofluorescence Panel Cells 2023

04、CD226 identifies functional CD8+ T cells in the tumor microenvironment and predicts a better outcome for human gastric cancer Front Immunol.2023

05、Single-Cell Profiling of Tumor Immune Microenvironment Reveals Immune Irresponsiveness in Gastric Signet-Ring Cell Carcinoma Gastroenterology 2023