背景

三级淋巴结构(Tertiary lymphoid structures，TLS)，又名第三淋巴样器官或异位淋巴样结构，是非生理条件下非淋巴组织中后天产生的有组织的免疫细胞聚集体，一般出现于自身免疫性疾病、慢性感染、癌症所致的慢性炎症组织中。除了少数特殊情况以外，若肿瘤中出现TLS，一般都意味着免疫治疗后的预后和临床结果更好。

TLS在肿瘤中存在于不同的成熟状态下，最终形成生发中心。一些研究表明，肿瘤特异性T细胞免疫和B细胞免疫可能诱导一些细胞因子，这些细胞因子可驱动TLS形成并有助于TLS维持。而且不同的驱动因素也可能导致不同的TLS状态。TLS在适应性抗肿瘤免疫反应中的作用机制正在被破译。对TLS存在与癌症患者临床获益之间的相关性的描述，表明TLS可能是一个预后和预测因素，已经引起了人们对研究TLS在肿瘤中的作用的强烈兴趣。

TLS中主要包含B细胞、滤泡树突状细胞（FDC）、T细胞、成纤维网状细胞（FRC）、基质细胞、树突细胞、中性粒细胞、巨噬细胞以及内皮细胞。其中FDC通常位于B细胞中心，表达各类受体，促进抗原呈递至B细胞表达高活性的抗体。内皮细胞位于TLS边缘。此外，在T细胞区域内，也有一些FRC，此类细胞与体内微环境结合，调解T细胞的功能。

乳腺癌局部

肺腺癌局部

结肠癌局部

通过组织原位分子结构、细胞结构、组织结构的定量信息，对其在 空间位置上的互相关系信息进行数字化定量分析，并在大数据水平 进行模式分析。

左图绿色区域是利用Tissue Cytometry技术中人工智能Classifier功能对TLS组织区域特异性识别（乳腺癌样本，红色CD3,黄色CD20,粉色CD23）  

右图为根据TLS结构，计算出TLS内外的CD20分布。

追溯验证组织内新生血管数量及面积，进而辅助推断对肿瘤生长及扩散或对其他组织结构的影响（红色圈出，88.67%）

组织水平分析

在石蜡包埋的甲状腺癌组织切片上对切片进行TSA酪胺信号放大技术，采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定地共价结合荧光素。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，避免交叉反应，如此往复实现多重荧光标记。其染色条件及染色指标见如下表：

染色服务

技术手段

多种研究手段在刻画肿瘤微环境中发挥作用，但也都存在一定程度的局限性，比如高通量测序技术包括新兴的空间转录组能够揭示细胞的基因组和转录组差异，却无法可视化细胞间的形态特征；流式细胞术能够筛选分析多种细胞型组分，却无法得知细胞的形态与空间位置信息；传统免疫组化能够直观标记某个蛋白的分布与表达，然而标记数量有限；通过连续切片技术虽然可实现多标，但是存在一定的误差，非真正意义上的单细胞多标。

多重免疫荧光技术在肿瘤微环境分析中具有独特优势，能够突破常规免疫荧光抗体种属限制，可实现在一张切片实现多个靶标(>9色)的标记，并能对细胞的表型，细胞间的原位空间信息，肿瘤微环境的生态群进行精准定量分析。

多重免疫荧光染色

通过阳性平均荧光强度(纵坐标)与面积(横坐标)作图

设阈值划分出CD20阳性细胞(红色标记)

图像分析服务

深度数据挖掘

多玛克引入散点图数据分析方法为您搜寻所需数据及图像，并对图像进行单细胞分辨率数据分析。采用细胞核识别算法，对组织切片中单细胞进 行统计分析，进一步通过细胞质算法获得 Panel 中每个指标阳性阈值，进而分析不同指标之间的共表达情况，鉴定不同细胞亚群。

两种或者更多的细胞关于任意参数都可以完成类似于双标或者多标的数据分析(包含：面积、平均染色强度、当量直径、周长、紧致度、离心率、长度、宽度等十八个 参数；结合散点图数据分析方法帮助您从海量的表征数据中深度挖掘并提取关键信息)。

阳性信号有效平均面积

阳性信号平均荧光强度

细胞计数

细胞群占比

细胞群密度

阳性信号有效平均面积

阳性信号平均荧光强度

细胞计数

细胞群占比

细胞群密度

分析CD163+/CD68+双阳性细胞共表达情况。还可以通过正反向回溯方式复查共表达细胞在组织原位的位置点对数据的真实性进行反复校验，提升数据的准确性。  (图中红色箭头)。

通过散点图逐级挖掘特定细胞

单细胞水平分析

透过热力图数据可以清楚的以三级淋巴结构区域为中心，微米级别精度对TLS区域周边浸润区域微环境中巨噬细胞细胞的空间分布进行单细胞量化分析。

以肿瘤细胞为中心寻找距离肿瘤细胞一定距离30μm内的细胞毒性T细胞、效应T细胞、调节T细胞及其数量统计

以肿瘤区域为中心，微米级别精度对微环境中免疫细胞的空间分布进行单细胞量化分析，不同颜色代表距离肿瘤的不同距离范围。

相关文献：

01.Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy，Catherine Sautès- Fridman et al，Nature reviews cancer 2019

02.Single-cell transcriptomics reveals granzyme K–expressing cytotoxic Tfh cells in tertiary lymphoid structures in IgG4-RD  R Aoyagi ,ec al. Journal of Allergy and Clinical Immunology  2023

03.A transcriptionally distinct CXCL13+ CD103+ CD8+ T-cell population is associated with B-cell recruitment and neoantigen load in human cancer H Workel,ec al. Cancer Immunology Research 2020

多维度原位空间层面精准定量数据分析

对特定组织或结构分层划分实现组织微环境的细化分析，提供组织-组织，细胞-细胞，细胞-组织间的形态分布及蛋白表达关系的大数据统计及分析。